El origen del Archivo Nacional, como institución, se inicia con la fundación del Cabildo, el 16 de setiembre de 1541, siendo el acta de fundación, el primer documento oficial producido en la ciudad. En 1544, Asunción sufrió un gran incendio, y el edificio del Cabildo sufrió daños, no así su Archivo, por lo que las juntas se celebraban en casas particulares, ya en 1609 el Gobernador Hernando Arias de Saavedra ordena el traslado del archivo de la morada donde se lo guardaba, al local del Cabildo recién inaugurado. En el Archivo del Cabildo guardaban celosamente las actas de acuerdos del Cabildo, las Cédulas y Reales Provisiones, autos, cartas a virreyes y gobernadores, elecciones de concejiles y muchos otros legajos.
Durante la Guerra contra la Triple Alianza, el Archivo Nacional sufrió su más terrible pérdida, seguido por el daño causado durante el traslado en lomo de mula y tren hasta Asunción. El Presidente Cirilo Antonio Rivarola nombra a José Falcón como el responsable de la reorganización del Archivo Nacional, tarea que vino cumpliendo desde antes de la guerra, bajo el Gobierno de Francisco Solano López; a comienzos del siglo XX, se crea la Dirección General de Bibliotecas, Museo y Archivo de la Nación a cargo de Juan Silvano Godoy. En 1898 se inicia la construcción de la Biblioteca Nacional sobre las calles Mariscal Estigarribia e Iturbe pero la misma sufrió daños tras la revolución de 1912. Luego del arreglo del edificio, en 1913, el Archivo Nacional se muda a la Biblioteca y allí permanece hasta el presente. La Colección de Enrique Solano López adquirida por el Estado fue depositada en uno de sus salones, aunque en forma provisoria; sin embargo, quedó anexada al Archivo. Doroteo Bareiro fue el primer paleógrafo paraguayo del Archivo Nacional, con sus casi cuatro décadas de trabajo acumulado, supo custodiar celosamente los documentos. Se destaca también el trabajo de Aníbal Solís, colaborador permanente de investigadores y estudiantes que solicitaban su ayuda en materia paleográfica.
En 1950 se crea por Ley la Dirección General de Archivos, Bibliotecas y Museos de la Nación, dependiente del Ministerio de Educación y Culto. A finales del siglo XX se instituyó la Subsecretaría de Cultura (1991), dependiente del Ministerio de Educación y Culto; la misma se elevó a la categoría de Secretaria Nacional de Cultura (2008) con rango ministerial, adjunta al Poder Ejecutivo. Actualmente la responsable directa de los Archivos, Bibliotecas y Museos de la Nación es la Dirección General de Bienes y Servicios Culturales. El Archivo Nacional, es el más antiguo del Río de la Plata, ya que guarda documentos desde 1534 en adelante; sus registros abarcan los siglos XVI y XIX. Contiene aproximadamente 7.000 volúmenes, más de 2.000.000 de expedientes.